ER-positive, HER2-negative Mammakarzinome sprechen in der Regel auf eine antihormonelle Therapie mit Aromataseinhibitoren (AI) an. Bis zu 40 Prozent der hiermit behandelten Patienten entwickeln jedoch eine durch ESR1-Mutationen ausgelöste Resistenz gegen diese endokrine Standardtherapien. Aktivierende Mutation in der ESR1-Ligandenbindedomäne bewirken eine ligandenunabhängige konstitutive ESR1-Aktivierung welche zu einer Resistenz gegen führen.

Patienten, bei denen eine solche ESR1-Variante vorliegt, können nun jedoch von einer zielgerichteten Behandlung mit Elacestrant (Handelsname Orserdu) profitieren. Elacestrant ist ein selektiver östrogen-Rezeptor-Degrader (SERD), der gezielt an östrogenrezeptor-Proteine mit einer aktivierenden ESR1-Variante bindet und diese degradiert, so dass keine Wachstumssignale mehr über den Rezeptor gesendet werden können.
Elacestrant kann bei Patienten eingesetzt werden, deren Mammakarzinom eine Resistenz gegen endokrine Standardtherapien, auch unter Verwendung eines CDK-4/6-Inhibitors, entwickeln.

ESR1 Struktur und Mutationen

Aktivierende, klinisch signifikante Mutationen zeigen sich in der AF2/LBD (Activation function-2 / Ligand Binding Domain), welche von den Kodons 355 bis 596 reicht.

Die aktivierenden Mutationen konzentrieren sich stark auf zwei Hotspots um die Kodons 380 und 537/538:


Unser dPCR-Assay erfasst folgende 8 aktivierende ESR1-Mutationen der AF2/LBD-Domäne:
E380Q, D538G, L536H, Y537C, L536P, Y537N, L536R, Y537S

Anzahl der in COSMIC dokumentierten Alterationen mit Effekt auf eine Aminosäure in der AF2/LBD-Domäne mit >4 Einträgen: 661

Anzahl der von unserem Assay erfassten COSMIC Mutationen: 593 (89,7 % der Mutationen)

Erfassung der COSMIC-Mutationen und deren Häufigkeit im Detail





Unser dPCR-Assay deckt 90% der signifikanten, aktivierenden ESR1 Mutationen der AF2/LBD-Domäne ab.

Methodik

cfDNA kommt natürlicher Weise in geringen Konzentrationen u. a. im Blut vor und stammt von z. B. apoptotisch zugrunde gegangenen Zellen. Der größte Teil der cfDNA ist in 165bp oder einem Mehrfachen von 165bp fragmentiert, was die Nukleosomen (DNA-Histon-Komplex) widerspiegelt.
Die cfDNA aus nekrotischen Zellen kann aus weit größeren Fragmenten bestehen.


cfDNA kann DNA verschiedener Ursprünge enthalten: circulating tumor DNA (ctDNA), cell-free mitochondrial DNA (ccf mtDNA), cell-free fetal DNA (cffDNA) u. a.

Das Target der Molekularpathologie ist natürlich die circulating tumor DNA = ctDNA, deren Konzentration im Blut von vielen Faktoren wie Tumormasse, Zustand und Therapie des Patienten, etc. beeinflusst wird.

Eine valide Untersuchung der ctDNA wird eine gewisse analytische Herausforderung im Bereich der Spurenanalytik.
Obwohl zur Probenahme spezielle Blutröhrchen mit einer Stabilisierungslösung verwendet werden sollten die Proben möglichst frisch sein, keinen warmen Temperaturen und keinem mechanischen Stress, z. B. starken Erschütterungen ausgesetzt sein.
Zur Probenahme sollten keine dünnen Kanülen verwendet werden, um ein Scheren der DNA-haltigen Leukozyten zu vermeiden, was die ctDNA stark mit Leukozyten-DNA verdünnen würde.

Im Labor werden die Blutproben relativ lange und sanft zentrifugiert. Das separierte Plasma wird abgenommen und in spezielle, aufwendige Isolationsverfahren für ctDNA eingesetzt.
Auch im Optimalfall sind die Ausbeuten der ctDNA im Vergleich zu DNA aus Geweben üblicherweise sehr gering und im Nanogrammbereich.

Digitale PCR (pPCR)
Bei der dPCR wird eine möglichst große Menge an DNA-Isolation in allelspezifische PCRs eingesetzt, deren jeweilige Positivität durch eine erscheinende Fluoreszenz (FRET-Sonden) detektiert wird.
Der Trick der dPCR: das Ansatzvolumen der PCR wird in tausende (>20.000 je Target) separate mikro-Volumina aufgeteilt. Dabei werden je Probe und je spezifischen PCR-Target defacto abertausende PCRs parallel durchgeführt und durch Detektion der Fluoreszenzen der Anteil der positiven PCRs bestimmt. Da das Ergebnis je Mikro-PCR binär d. h. negativ oder positiv ist: digitale PCR.